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          行業動態 Industry News

          RET基因與腫瘤

          發布時間:2021-05-20 10:28:51 | 來源:【藥物研發團隊 2021年5月15日】
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          RET屬原癌基因,負責編碼一種稱為RET的跨膜蛋白,該蛋白屬于一種受體酪氨酸激酶??缒さ鞍追譃槿齻€部分:蛋白的一端位于細胞外,一部分位于細胞膜中,另一端則位于細胞內。當RET蛋白與其配體—細胞外信號分子家族的膠質細胞源神經營養因子(GDNF)結合時,其將引起RET蛋白受體的磷酸化并使RET進入激活狀態。被激活的RET將磷酸化其底物,造成下游信號通路的激活。

          RET基因發生致病性融合和突變,可激活RET基因,可能編碼出具有異?;顒拥腞et蛋白,其將傳遞異常信號并造成多方面的影響,包括細胞生長、生存、侵襲、轉移等。持續的異常信號傳遞會造成細胞的過度增殖,因此導致腫瘤的發生與進展。

          一、RET基因

          RET基因是一個在轉化中發生重排的原癌基因,且因此行為而得名。1985年,Tak ahashi利用人淋巴瘤細胞DNA轉化NIH3T3細胞,分析轉化子細胞,發現一個新基因,它因與其他基因重排而活化。因為在轉化中發生重排,故將它命名為RET基因。

          RET原癌基因位于常染色體10q 11.2,含有20個外顯子,全長約60kb,其內含子1序列長24kb。人神經細胞轉錄RNA在外顯子20可變剪接后,產生5種mRNA分子,分別為7.0、6.0、4.6、4.5和3.9kb。其中7.0、4.5和3.9kb RNA編碼1072個氨基酸的Ret肽鏈,而6.0和4.6kb的RNA編碼1114個氨基酸的Ret多肽,分子質量分別為117ku、122ku;兩個蛋白質部分糖基化后分子質量分別為150和155ku,不能整合到細胞膜;完全糖基化后分子質量分別為170和175ku,則具備細胞膜受體功能。迄今發現3種Ret同型蛋白,它們的N端1063個氨基酸均相同,C端各有9個、43個或51個氨基酸,因此分別命名為RET9、RET43和RET51。

          二、Ret蛋白

          RET原癌基因編碼細胞跨膜糖蛋白Ret,Ret蛋白是受體酪氨酸激酶(RTK)家族的一個成員,可以激活下游多種信號途徑,如RAS、PI3K及STAT等,誘導細胞增生。RET常以本身斷裂再與另一基因融合,重組成一新基因,具備自我磷酸化且持續激活的功能,KIF5B-RET、CCDC6-RET、TRIM33-RET和NCOA4-RET是非小細胞肺癌中已發現的RET融合基因,是繼ALK、ROS1之后與肺癌密切相關的第三種融合基因。

          Ret蛋白的信號肽由28個氨基酸組成,成熟蛋白N端的疏水系列結合受體分子;胞外區含608個氨基酸,第636~657位22個氨基酸組成跨膜結構,此區域富含Cys,它在配體結合后介導Ret二聚體化,第713位氨基酸的編碼位點是基因重排位點;胞內第726~999位氨基酸組成酪氨酸激酶結構,為典型TK結構。

          Ret蛋白胞外區與RTK分子如EGF、PDGF等無同源性,且在胞外中段有獨特的類鈣黏著蛋白結構,由110個氨基酸組成,與鈣黏著蛋白有30%的同源性;鈣黏著蛋白是依賴鈣離子介導細胞相互作用的黏附分子,目前對Ret蛋白此結構的功能還不完全了解。

          Ret蛋白結構

          Ret蛋白屬于受體酪氨酸激酶蛋白家族中的成員,該受體是一種蛋白聚合體,是細胞生長和分化傳導信號的細胞表面分子。Ret蛋白包括富含半胱氨酸的胞外區、跨膜區和包含有酪氨酸激酶(TK)的胞內區部分。細胞外區包含4個類黏附素的重復片段,1個鈣結合區和1個富含半胱氨酸的結構區。其中類黏附素的重要片段區域與細胞間信號傳遞密切相關;富含半胱氨酸結構區則主要參與受體的二聚化。細胞內區是一個含有TK的結構區,在受體與配體結合后,胞內區的TK磷酸化,激活下游信號轉導通路,誘導細胞增生。研究證實,在跨膜部分的富含有半胱氨酸的細胞外區存在Ret的配體,即神經膠質細胞源性神經營養因子(GDNF),artemin及persephin也被證實是Ret蛋白的配體。此外,細胞膜上還存在Ret蛋白的共受體,是一種糖磷脂酰肌醇連接蛋白。不同受體及配體在組織中的表達不同,功能也不一樣。

          Ret蛋白功能

          1、Ret蛋白介導的信號轉導

          與許多單一跨膜受體一樣,Ret蛋白調節細胞的生長、分化。在配體誘導下二聚體化,兩單體交叉使各自的酪氨酸殘基磷酸化,而后磷酸酪氨酸序列結合含SH2結構的底物分子,使底物分子磷酸化,將信號傳導至下游,進一步誘導細胞反應。Ret蛋白高度保守的TK區Gly-X-Gly-X-X-Gly-X-(Lys)序列作為結合ATP分子—酪氨酸殘基磷酸化的磷酸基因供體。Ret蛋白被激活后結合RAS調節途徑的適配子SHC并使之磷酸化;使RAS-GAP相關蛋白質p62和p190磷酸化,GTP-RAS復合物增加,也導致RAS活化。但是,Ret蛋白能使PLCγ磷酸和激活,使磷酸酰肌醇二磷酸(PIP2)降解,不導致磷脂酰肌醇-3-激酶活化。

          通常RTKs的轉導途徑中GTP-RAS復合物增多常常導致MAP激酶活化,然而,在Ret蛋白引發的途徑中,RAS和MAP激酶和活化之間無相關性,表明Ret蛋白介導的信號轉導途徑較為獨特。

          Ret蛋白是否結合另一細胞的Ret分子,發生細胞間識別以及配體是一個其他膜受體或可溶性配體,目前還不清楚。三種Ret蛋白C端結構提供不同的蛋白質磷酸化和底物結合位點,可能與分子適配子的結合方式略有區別。

          有研究者認為Ret蛋白的配體可能是膠質細胞衍生神經營養因子(GDNF),因為RET純合缺失小鼠與GDNF缺失小鼠的表型相同。

          2、Ret蛋白的生理功能

          在不知道Ret蛋白配體的情況下,人們從小鼠和大鼠的胚胎發肓和分化組織研究RET基因的表達,以期了解它的受體功能。

          原位雜交分析表明,小鼠8.5天以后的胚胎,在周圍、神經系統,排泄系統等都有RET表達。免疫組化學也顯示,大鼠妊娠第9和11天之間的胚胎組織RET基因mRNA大量表達。妊娠中期第12.5~14.5天,在第四菱腦結節神經嵴細胞和胚腎管細胞、排泄系統有RET基因表達;而在腎上腺嗜鉻祖細胞,甲狀旁腺祖細胞同樣存在RET基因高轉錄活性。成年大鼠的腦、胸腺、肺、心、脾、睪丸及小腸中雖有RET基因表達,而在胚胎中的mRNA表達水平高出成年組織約20~50倍,從妊娠第14天開始降低到成年個體組織的水平。

          RET雜合缺失小鼠后代表現正常,而其純合缺失后代出生時表現正常,但于16~24h后死亡。組織學檢查發現腎退化及缺失。RET純合缺失小鼠的另一個異常是胃腸蠕動缺陷,吸入乳汁不能由胃進入小腸,具有人類巨結腸疾病表型。組織學分析表明,從食道至胃、小腸及大腸的腸肌間神經叢的神經元均缺乏。

          與動物組織相似,RET也在人腸神經節細胞、神經母細胞瘤、嗜鉻細胞瘤、甲狀腺髓樣瘤、甲狀腺C細胞和黑素細胞等細胞中表達,而在其他25種人體腫瘤組織中卻未檢測到,表明人體組織RET基因表達及其蛋白功能同樣具有特異性。

          總之,RET的特異表達及動物實驗表明,作為RTK,Ret蛋白介導的信號轉導,對調節神經嵴細胞的增殖、分化、遷移到腸壁,對腸神經系統的發育,對腎臟輸尿管芽形成及腎組織器官發肓,對神經內分泌系統的發肓都起著重要作用,其功能在RET基因突變與人類疾病發生相關的事實中得到了印證。

          三、RET基因異常激活

          受體酪氨酸激酶在細胞外環境與細胞核之間起著連接作用,信號從細胞表面傳導到細胞質,再到細胞核。該受體的細胞外部分區域在連接特殊的配體后形成受體間聚合,促使激酶的激活。一旦受體被激活,就會發生信號的級聯放大,所有信號都可以通過特殊底物磷酸化而被傳遞,即RET的二聚化、自體磷酸化和細胞內底物磷酸化。

          RET基因突變在多方面增強了RET酪氨酸激酶信號轉導的功能,促使激酶的活化和原癌基因的轉化,其機制是由于氨基酸位點的變化:Ret蛋白細胞外半胱氨酸區域外顯子10和11的突變阻止了分子間二硫鍵的形成,使游離的半胱氨酸殘基形成分子間鍵,形成畸變的同源二聚體,自發啟動細胞內酪氨酸殘基磷酸化,激活下游信號途徑;位于細胞內的酪氨酸激酶區域外顯子13~16的突變,使Ret激酶催化特性及底物磷酸化發生改變而異常激活,而不適當的底物磷酸化使RET不能正常參與信號轉導通路而引發疾病的發生。

          RET突變發生位點不同,導致酪氨酸激酶轉化活性增強的程度也不同:編碼細胞外區的密碼子突變,導致細胞外區域半胱氨酸殘基的改變,使得Ret受體酪氨酸蛋白不再依賴配體的激活而自我交叉磷酸化,從而達到激活的狀態;編碼跨膜區密碼子突變導致兩個受體蛋白以非共價鍵靠近,進而達到激活的狀態;編碼細胞區內密碼子突變易化了ATP與其位點結合,達到激活狀態;編碼細胞內催化核心的密碼子突變導致受體酪氨酸激酶與細胞底物優先結合,達到激活狀態。RET不同的基因型突變導致受體酪氨酸激酶具有不同的轉化活性。有研究者認為細胞外區域RET突變位點距細胞膜越近,受體酪氨酸激酶轉化的活性就越強。

          截至目前,在腫瘤中已報道了三種異常的RET激活機制:框內RET基因融合、RET基因自身的靶向突變、RET基因的異常過表達。這三種機制的共同點是常常在完全沒有配體的情況下,酪氨酸激酶的不適當激活。磷酸酪氨酸1062(PY1062)PY1069的多功能對接點是主要的RET信號樞紐,適配器蛋白與上述對接位點結合可激活RAS-MAPK和PI3K-AKT信號通路。

          四、Ret蛋白參與的信號通路

          Ret蛋白參與的信號通路包括PI3K-AKT-mTOR途徑以及RAS-RAF-MEK-ERK途徑。PI3K-AKT-mTOR途徑參與細胞存活,而RAS-RAF-MEK-ERK通路參與細胞增殖。因此Ret蛋白在細胞存活、遷移、增殖上有著一定的作用。

          五、RET基因與腫瘤

          RET基因的異常激活可能編碼出具有異?;顒拥腞et蛋白,其將傳遞異常信號并造成多方面的影響,包括細胞生長、生存、侵襲、轉移等。持續的信號傳遞會造成細胞的過度增殖,因此導致腫瘤的發生與進展。

          已有研究顯示,1%~2%的非小細胞肺癌(NSCLC)、10%~20%的乳頭狀甲狀腺癌(PTC)、60%~90%的甲狀腺髓樣癌(MTC)、5.6%的腦膜瘤、1.4%的食管腺癌、0.7%的黑色素瘤、12.5%的基底細胞癌、0.2%的乳腺癌、0.7%的胃癌、16.7%的輸尿管尿路上皮癌、1.9%的卵巢上皮癌、0.7%的大腸腺癌以及慢性粒單核細胞白血病患者中可見RET基因融合和突變。常見的RET融合有RET-KIF5B和RET-CCDC6。RET基因融合被認為致癌的原因主要有兩點,一是基因融合提供了一種在正常轉錄過程中沉默的細胞類型異常表達RET的機制;二是胞外結構域均被蛋白質二聚體結構域取代,導致細胞內RET酪氨酸激酶結構域不依賴配體而激活。但是,盡管缺乏跨膜區,RET融合蛋白仍然能夠通過MAPK和PI3K-AKT通路激活。然而,RET融合的細胞功能尚未進行廣泛探索。

          六、靶向RET的抑制劑

          已批準上市或正在研發的RET靶向抑制劑主要有以下幾個:

          凡德他尼

          凡德他尼(Vandetanib)是由英國阿斯利康制藥有限公司(AstraZeneca)研發的小分子多靶點酪氨酸激酶抑制劑。于2011年4月獲美國FDA批準上市,商品名為Zactima。該藥為片劑,用于成年患者晚期甲狀腺髓樣癌的治療。凡德他尼是一種多靶點酪氨酸激酶抑制劑,屬苯胺喹唑啉類化合物,被稱“二代易瑞沙”,不僅作用于腫瘤細胞的EGFR、VEGFR和RET酪氨酸激酶,還可抑制其他酪氨酸激酶以及絲氨酸/蘇氨酸激酶。凡德他尼是第一個批準的髓樣甲狀腺癌治療藥物,適用于治療不能切除、局部晚期或轉移的有癥狀或進展的髓樣甲狀腺癌。

          卡博替尼

          卡博替尼(Carbozantinib)是由美國Exelixis公司研發的VEGFR、c-Met、RET等多靶點酪氨酸激酶抑制劑。

          1、2012年11月29日獲美國FDA批準用于治療甲狀腺髓樣癌,商品名Cometriq。

          2、2016年4月獲美國FDA批準用于治療既往接受過抗血管生成治療的晚期晚期腎癌(RCC)患者,商品名Cabometyx。

          3、2017年12月獲美國FDA批準擴大適應癥,用于晚期腎癌一線治療。

          4、2019年1月14日獲美國FDA正式批準用于晚期肝癌患者的二線治療。

          舒尼替尼

          舒尼替尼(Sunitinib)原研企業為美國輝瑞公司,商品名為Sunitinib,于2006年1月獲美國FDA批準上市。

          2006年6月在歐盟獲批上市,2007年獲批進入中國市場,商品名:索坦。

          原研舒尼替尼我國獲批的的主要適應癥包括:

          1、不能手術的晚期腎細胞癌(RCC)。

          2、甲磺酸伊馬替尼治療失敗或不能耐受的胃腸間質瘤(GIST)。

          3、不可切除的,轉移性高分化進展期胰腺神經內分泌瘤(pNET)成年患者。

          舒尼替尼被權威指南高證據等級推薦用于一線所有病理學分類腎細胞癌。

          2019年美國國立綜合癌癥網絡(NCCN)腎細胞癌指南推薦內容:腎透明細胞癌,一線治療選擇優先舒尼替尼,證據等級為1類推薦;腎非透明細胞癌,一線治療優選舒尼替尼,證據等級為2A類推薦。

          舒尼替尼中國IV期研究是國內單藥治療晚期腎細胞癌的前瞻性、開放性、單臂多中心研究,共納入105例患者。研究顯示:舒尼替尼初始治療中國晚期腎癌患者PFS達14.2個月,OS超過30個月。

          一項非直接對照薈萃分析,納入評價舒尼替尼、索拉非尼、貝伐珠單抗治療腎細胞癌患者的隨機對照研究(對照藥物為IFN-α),旨在評價舒尼替尼、索拉非尼和貝伐珠單抗的相對療效。研究顯示舒尼替尼PFS優于索拉非尼。

          舒尼替尼是目前臨床上使用的多靶點酪氨酸激酶抑制劑之一。其作用靶點包括:PDGFR(PDGFRα和PDGFRβ)、VEGFR(VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3)、FLT-3、CSF-1R、Kit和Ret等數十種。

          受體酪氨酸激酶(RTK)的突變和過度表達被證實與包括肺癌在內的多種腫瘤的發生及發展有關。因此部分學者進行了用索坦(舒尼替尼)單藥或聯合化療藥物(如紫杉醇、吉西他濱+順鉑)治療進展期非小細胞肺癌的臨床試驗,試驗結果顯示索坦(舒尼替尼)對非小細胞肺癌有一定的療效。

          索拉非尼

          索拉非尼(sorafenib)由德國拜爾公司研發,2005年12月獲美國FDA批準作為治療晚期腎癌的一線藥物上市;2007年10月獲歐洲EMEA批準索用于治療肝細胞癌;2007年11月,美國FDA批準索拉非尼(多吉美)用于治療不能切除的肝細胞癌。2009年8月,中國國家食品藥品監督管理局批準索拉非尼(多吉美)用于不能手術的晚期肝癌患者治療。索拉非尼的主要作用靶點是VEGFR 1-3,PDGFRβ,c-KIT,FLT-3,RET,BRAF和c-RAF。

          塞爾帕替尼

          塞爾帕替尼(selpercatinib),商品名:Retevmo,即LOXO-292。2020年5月8日,禮來制藥的Retevmo在美國獲批上市,它是第一個被批準專門用于攜帶RET基因變異的癌癥患者的靶向藥。在RET陽性非小細胞肺癌的前期研究中,39例未接受過系統性治療的RET融合突變非小細胞肺癌患者,使用LOXO-292以后,85%的患者腫瘤顯著縮小。105位化療后耐藥進展的RET融合突變非小細胞肺癌患者,使用LOXO-292以后,64%的患者腫瘤再次顯著縮小,81%的患者緩解持續時間至少為6個月。而且,塞爾帕替尼能夠透過血腦屏障對腦轉移病人效果顯著。

          普拉替尼

          普拉替尼(BLU667),由基石藥業和戰略合作伙伴BlueprintMedicines共同開發的一款口服RET抑制劑,2020年9月4日,美國FDA加速批準普拉替尼用于治療成人轉移性RET融合陽性非小細胞肺癌。普拉替尼的I/II期ARROW臨床試驗顯示,先前接受過鉑類化療的87位患者,接受普拉替尼治療后,總緩解率為57%,完全緩解率為5.7%。而在27名未接受過鉑類化療的患者中,總緩解率為70%,完全緩解率為11%,中位緩解持續時間為9個月。

          LMV-12HE003

          LMV-12(HE003)是南昌弘益藥業研發的一種新型多靶點酪氨酸激酶抑制劑,除c-Met、VEGFR2外,LMV-12(HE003)RET也有較強的抑制作用,目前正在開展I期臨床研究。已將LMV-12(HE003)片對晚期甲狀腺髓樣癌、腎癌、肺癌患者的有效性和安全性納入臨床試驗探索研究的范圍,期待能有良好的臨床表現。

           

          文獻資料

          1、毛建平等,Ret:一種受體酪氨酸激酶及其基因突變與疾病,生物化學與生物物理進展,1998,25(6):513~517

          2、吳霞等,RET原癌基因及其突變與疾病

          3、NCBI Gene. Retrieved from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/5979

          4、Espinosa, A., J. Gilbert. 2015. RET. My Cancer Genome. Retrieved from: https://www.mycancergenome.org/content/disease/lung-cancer/ret/?tab=0 (Updated December 7).

          5、美國國立衛生研究院,National Institutes of Health. (2018). URL:https://ghr.nlm.nih.gov/gene/RET

          6、美國國立綜合癌癥網絡NCCN. (2019). Non-Small Cell Lung Cancer.

          7、Vivek Subbiah Gilbert J Cote. Cancer Discov.202 Apr;10(4):498~505

           

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